เจ้าหน้าที่วิศวกรรมสถานแห่งประเทศไทย ในพระบรมราชูปถัมถ์ หรือ วสท.  ระบุ สาเหตุสะพานอยุธยาถล่ม ว่า น่าจะเป็นความผิดพลาดในขณะก่อสร้าง โดยพบว่า อุปกรณ์การก่อสร้างสะพาน บางชิ้นหลุดหายไป   จึงสันนิษฐานว่าเป็นสาเหตุทำให้โครงสร้างชั่วคราวเสียเสถียรภาพ
 
วิศวกรรมสถานแห่งประเทศไทยในพระบรมราชูปถัมถ์หรือวสท. และสภาวิศวกร ลงพื้นที่สำรวจวิเคราะห์ในพื้นที่อุบัติภัยจากชิ้นส่วนคานสะพานคอนกรีตหล่อสำเร็จหรือเซ็กเมนท์ 9 ชิ้น ที่เชื่อมระหว่าง 2 ตอม่อของสะพานข้ามแม่น้ำเจ้าพระยาแห่งใหม่ ซึ่งอยู่ระหว่างการก่อสร้างแล้วถล่มลงมา ที่ตำบลสำเภาล่ม จังหวัดพระนครศรีอยุธยา เมื่อวันที่ 5 มกราคม 2559  ที่ผ่านมา พบว่าจุดที่เกิดเหตุเป็นสะพานแบบคานรูปกล่องคอนกรีตสร้างใหม่ ข้ามแม่น้ำเจ้าพระยาจากถนนสายอยุธยา-บางปะอินเกิดถล่มระหว่างที่กำลังติดตั้งชิ้นส่วนคานสะพานคอนกรีตหล่อสำเร็จจำนวน 12 ชิ้น ซึ่งยกขึ้นรองเพื่อรอร้อยลวดอัดแรงจำนวน 9 ชิ้น ก่อนจะเคลื่อนไปเชื่อมระหว่าง 2 ตอม่อของสะพาน   

การตรวจสอบในเบื้องต้นพบว่า สะพานที่กำลังก่อสร้างซึ่งเป็นส่วนที่เกิดปัญหาขึ้นนั้น จากการดูโครงสร้างของตัวสะพานแถวที่สร้างเสร็จแล้วทำให้เห็นได้ว่า มีอุปกรณ์ติดตั้งคานสะพานด้วยโครงเหล็กเลื่อนเพื่อช่วยรับน้ำหนักบรรทุกไม่สามารถรับน้ำหนักได้ทำให้โครงเหล็กเลื่อนเสียเสถียรภาพและพลิกร่วงลงมาทำให้ชิ้นส่วนสะพานหรือเซ็กเมนท์ที่ห้อยติดไว้ใต้โครงเหล็กเลื่อนร่วงหล่นลงมาด้วย ขณะเดียวกันปลายของฐานตอม่ออีกต้นหนึ่งที่สร้างเสร็จแล้วก็ถูกดึงจนหักไปด้วยคาดว่า น่าจะเป็นความผิดพลาดในขณะก่อสร้าง